Năm 1884, nhà vi sinh học người Pháp Charles Chamberland phát minh ra bộ lọc Chamberland (hay bộ lọc Chamberland–Pasteur), chứa những chiếc lỗ có kích cỡ còn nhỏ hơn cả vi khuẩn. Sau đó, ông đổ dung dịch chứa vi khuẩn qua bộ lọc này loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn. Đầu những năm 1890, nhà sinh vật học người Nga Dmitri Ivanovsky sử dụng phương pháp này để nghiên cứu về thứ mà hiện nay được biết với tên virus khảm thuốc lá. Thí nghiệm của ông cho thấy rằng dung dịch chiết xuất từ lá cây nghiền nát của cây thuốc lá bị nhiễm bệnh vẫn có khả năng lây nhiễm sau khi lọc.[2]

Trong khoảng thời gian đó, một số nhà khoa học khác phát hiện ra rằng mặc dù các "tác nhân" này (sau này được gọi là virus) khác với vi khuẩn và nhỏ hơn vi khuẩn khoảng một trăm lần, nhưng chúng vẫn gây bệnh. Năm 1899, nhà vi sinh học người Hà Lan Martinus Beijerinck quan sát thấy rằng "tác nhân" chỉ nhân lên khi tế bào chủ diễn ra hiện tượng phân bào. Ông gọi nó là "mầm sống có thể hòa tan" (tiếng Latin: contagium vivum fluidum), vì ông không thể tìm thấy bất kỳ hạt vi trùng nào.[3] Đầu thế kỷ 20, nhà vi khuẩn học người Anh Frederick Twort phát hiện ra virus lây nhiễm vi khuẩn.[4] Nhà vi sinh học người Canada gốc Pháp Félix d'Herelle mô tả rằng: khi thêm "tác nhân" này vào đĩa thạch nuôi cấy vi khuẩn thì sẽ có hiện tượng hình thành vùng vi khuẩn bị chết. Tính toán diện tích những vùng này cho phép ông tính được số lượng virus trong dung dịch ban đầu.[5]

Phát minh kính hiển vi điện tử năm 1931 mở ra cánh cổng rộng lớn cho ngành vi sinh học, cho ra những bức hình đầu tiên về virus.[6] Năm 1935, nhà hóa sinh học và virus học người Mỹ Wendell Meredith Stanley nghiên cứu virus khảm thuốc lá và thấy được virus chủ yếu được làm từ protein.[7] Một thời gian ngắn sau, virus được chứng minh cấu tạo từ protein và RNA.[8] Một vấn đề mà nhà khoa học ban đầu gặp phải là họ không biết cách nuôi cấy virus ngoài môi trường động vật sống. Năm 1931, các nhà bệnh ký học người Mỹ Ernest William Goodpasture và Alice Miles Woodruff nuôi cấy bệnh cúm và một số loại virus khác trong trứng của gà được thụ tinh. Đây là bước đột phá vì là lần đầu tiên virus được nuôi cấy ở ngoài cơ thể sống đã trưởng thành.[9] Tuy vậy một số virus không thể phát triển trong trứng gà. Vấn đề này đã được giải quyết vào năm 1949, khi John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller và Frederick Chapman Robbins phát triển virus bại liệt bằng phương pháp nuôi cấy tế bào động vật sống.[10] Hiện nay, hơn 4.800 loài virus đã được mô tả chi tiết.[1]